Hoefer IEF100 - Manual (Page 61)

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3. Equilibrio SDS Solución tampón
Esta solución se utiliza después de IEF, y antes de PAGE segunda dimen-
sión. Las tiras IPG se sumergen en exceso de disolución para elevar el pH
del tampón de tira de modo que sea adecuado para PAGE, y para recubrir
las proteínas en SDS uniformemente de modo que migran correctamente en
el gel de segunda dimensión.
Prepara 200 ml
6 M urea, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,3% de glicerol, 2% de SDS, 0,002%
de azul de bromofenol
Concentración final Cantidad
La urea (FW 60.06) 6 M 72,1 g
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 solución madre 75 mM 10,0 ml
El glicerol (87% w/w) 29,3% (v/v) 69 ml
SDS (FW 288.38) 2% (w/v) 4,0 g
Azul de bromofenol 0,002% (w/v) 4 mg
El agua desionizada a 200 ml
Dividir en partes alícuotas en alícuotas de 30 ml y conservar congelada a
-20 °C o menos.
24 cm de IPG requieren 5-10 ml por tira por el paso de equilibrio. Más
cortos pueden utilizar tiras volumen proporcionalmente menos por el paso de
equilibración.
Equilibrio Procedimiento
1 Descongelar dos alícuotas de la solución de equilibración.
2 Añadir 10 mg/ml de DTT a una solución.
3 Coloque las tiras de IPG en la bandeja de rehidratación/equilibrio.
4 Añadir 6,5 ml de solución a cada ranura que contiene una tira IPG.
5 Coloque el rockero de 10-15 minutos.
Después de la equilibración, desechar la solución de equilibración primero
en una forma adecuada.
6 Añadir 25 mg/ml de yodoacetamida (IAA) a la segunda parte alícuota
de la solución de equilibración.
7 Añadir 6,5 ml de solución a cada ranura que contiene una tira IPG.
8 Coloque el rockero de 10-15 minutos.
Después de la equilibración, desechar la solución de equilibración segundos
en una manera apropiada.
Después del equilibrio, las tiras IPG se colocan en la parte superior del
gel de segunda dimensión, y se sella en su lugar con la superposición de
agarosa.
Nota: Las tiras de IPG deben
equilibrarse justo antes de la
segunda dimensin PÁGINA. No se
equilibren las tiras IPG antes de
guardar a -20 °C.