Hoefer IEF100 - Manual (Page 58)

• p52
Directrices Generales
• Los procedimientos de preparación de muestras están siendo refi-
nados y estandarizados. Lo mejor es consultar la literatura para
determinar si un buffer de preparación de la muestra en particular
se recomienda para el tipo de muestra.
• IEF funciona mejor con muestras de proteínas puras que se solubili-
zan y desnaturalizado, y libre de las moléculas que interfieren.
• Retire el material insoluble con centrifugación.
• Mantener el contenido de sal tan bajo como sea posible.
• Utilice recién reactivos preparados de alta calidad, o soluciones de
los reactivos que se han almacenado congelados.
• No deje soluciones de urea a cabo a temperatura ambiente durante
períodos prolongados de tiempo.
• Nunca Calentar las muestras de proteínas en soluciones de urea.
Calentamiento carbamilación causa de las proteínas y se altera la
carga de las proteínas nativas.
• Cumpla con las muestras en hielo para evitar la degradación.
• Añadir inhibidores de la proteasa para prevenir la actividad de la
proteasa. Los inhibidores de proteasa tales como PMSF o Pefabloc
se puede añadir a inhibir la actividad de serina proteasa mientras
pepstatina puede inhibir proteasas aspárticas.
• Algunos protocolos utilizar anfolitos básicos portadores o Tris para
obtener un pH alto en el tampón de muestra. Esto ayuda a solu-
bilizar algunas proteínas y disminuye la actividad enzimática que
atacan las proteínas.
• ADN y ARN con frecuencia se pueden eliminar por ultracentrifu-
gación. La muestra también puede ser tratada con DNasa y RNasa
solución para descomponer los contaminantes.
• Tenga en cuenta que algunos inhibidores de la proteasa, DNasa y
RNasa son proteínas sí mismos y pueden aparecer en un mapa 2D.
• El agua utilizada para la fabricación de los reactivos deben ser de la
más alta calidad disponible. El agua con una resistividad de >5 cm
megaohm es mejor. El agua purificada por ósmosis inversa o agua
desionizada es aceptable.
Nota: Las sales son, quizás, el
contaminante más frecuente como causa
de los malos resultados del IEF.