Hoefer IEF100 - Manual (Page 57)

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Apéndice B: Reactivos y Soluciones
Preparación de la muestra
Las muestras preparadas para 2D debe ser totalmente desnaturali-
zado, libre de material insoluble, y baja en la fuerza iónica total.
Algunas muestras de proteínas fácilmente solubilizar, mientras que
otros son más difíciles, lo que requiere reactivos adicionales (por
ejemplo, tiourea, detergentes especiales, etc) para fomentar la solubili-
zación. Las clases de aditivos comunes se enumeran a continuación.
Desnaturalizantes
La urea es el reactivo más común usado en IEF para interrumpir la
unión interna de la proteína, permitiendo que se desarrollan. Las
muestras se prepararon utilizando concentraciones de urea 8 a 9,5 M.
En general, cuanto mayor sea la concentración de urea el mejor puede
ser una muestra solubilizada. La urea llega a su punto de saturación
cerca de 10 M a temperatura ambiente.
Tiourea también se utiliza para solubilizar mejor algunas muestras.
Con frecuencia, 2 M tiourea se combina con 5 a 7 M de urea como
un reactivo para la preparación de muestras y la rehidratación IPG.
Detergentes
Varios tipos de detergentes no iónicos o zwitteriónicos se puede utilizar
para solubilizar las muestras (CHAPS, Triton X100, Nonidet NP-40
y detergentes alkylamidosulfobetaine). CHAPS es el detergente más
ampliamente utilizado para la electroforesis 2D. Es estable en solución.
Detergentes tales como SDS no son compatibles con IEF porque se
unen a las proteínas y enmascarar carga de las proteínas nativas.
Reductores
Ditiotreitol (DTT) se utiliza comúnmente para reducir las proteínas de
la FEI. TDT descompone en solución, por lo que se prepara normal-
mente y se añadió justo antes del uso. Otros agentes reductores tales
como 2-mercaptoetanol, Ditioeritritol (DTE) y tributilfosfina (TBP) se
puede utilizar.
Otro
Anfolitos Carrier o tampones IPG puede ser añadido para ayudar en
la solubilidad de la proteína y ayudar a prevenir la precipitación de la
proteína durante el enfoque. Las concentraciones de 0,5%-2% (v/v)
se utilizan normalmente. Anfolitos Carrier puede interferir con cier-
tos experimentos de etiquetado. En esos casos, los reactivos debería
entonces ser omitido de la etapa de extracción de la muestra.
Clases más comunes de los aditivos
Desnaturalizantes
Despliegue de las proteínas para exponer
los cargos internos nativos.
Detergentes no iónicos
Realiza muestras más soluble, sin
alterar la carga de proteínas.
Reductores
Ayuda romper los enlaces disulfuro
internos a desarrollarse aún más las
proteínas, y ayudar a reducir los efectos
negativos de la oxidación de las proteí-
nas durante la rehidratación y el IEF.
Otro
Amphoytes Carrier, proteasas, DNasas,
ARNasas.