Hoefer HB1000 - Manual (Page 27)

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Procedura
1. Aggiungere 15 mL di soluzione per ogni bottiglia
preibridazione ibridazione contenente la macchia.
Rimuovere le bolle tra il vetro e macchia. Tappare
le bottiglie, le bottiglie collegare alle ruote della
giostra portabottiglie, e chiudere la porta del forno
ibridazione.
2. Incubare la blot a 42 °C per 1 ora.
3. Rimuovere la soluzione preibridazione e sostituire
con 10 ml di soluzione di ibridazione.
4. Se si utilizza sonde radiomarcati lavorare in
sicurezza dal lato di un beta-bloccante scudo.
Pipettare 1 × 10
6 conteggi per minuto di sonda
radiomarcata, o 200 ng di sonda biotinilata, in
un tubo di plastica da 15 ml. Sigillare la provetta
con un tappo di plastica e colpire un foro nella
parte superiore con un ago da siringa per evitare
l’accumulo di pressione durante l’ebollizione.
5. Denaturare la sonda ponendo i campioni in bagno
di acqua bollente e riscaldamento per 10 minuti.
Trasferire immediatamente la provetta in ghiaccio
per 5 minuti (per evitare rinaturazione). Aggiungere
5 mL di tampone di ibridazione della sonda e
trasferimento al flacone di ibridazione contenente
il blot. EVITARE versando la sonda direttamente
sulla macchia.
6. Incubare nel forno HB1000 ibridazione Hoefer per
6 a 8 ore a 42 a 56 °C.
Lavaggio del blot
• Tupperware contenitore (per contenere il blot)
• 0,1X SSC, 0,1% SDS (pre-riscaldato a 50 °C)
• 2X SSC, 0,1% SDS (temperatura ambiente)
• 2X SSC (temperatura ambiente)
• 0,15X SSC, 0,1% SDS (pre-riscaldato a 50 °C)
• Guanti
• Carta da filtro
• Cartone
• Involucro di plastica
• Nastro
Per le sonde radioattive, sarà inoltre necessario:
• X-ray film porta
• X-ray film
• Intensificare schermo