Hoefer HB1000 User Manual
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Reagenti
• Deionizzata, acqua sterile
• EDTA, 0,5 M
• DNA polimerasi, frammento di Klenow, 4-5 unità/mL
• Mix Nucleotide (300 pM ciascuno di dATP, dCTP,
dGTP e dTTP 60 pM)
• Casuale nonamer (9-mer) primer, 2,5 mg/µL in acqua
• Tampone di reazione, 10X (50 mM MgCl
2
, 10 mM
2-mercaptoetanolo, 500 mM Tris-HCl, pH 7,5)
• Tagged nucleotide: fluoresceina-11-dUTP
• DNA stampo in acqua (5 ng/mL)
Procedura
1. Pipettare 10 µL di DNA stampo più 10 µL di
acqua in una provetta da microcentrifuga e tappo.
Tappo sicura con una serratura tappo o utilizzare
una graffetta piegata per accertarsi che il cappuc-
cio non apparirà quando i contenuti sono bolliti.
2. Porre il tubo in bagno di acqua bollente per
5 minuti.
3. Porre immediatamente la provetta in ghiaccio per
5 minuti.
4. Centrifugare per 15 secondi in microcentrifuga.
5. Aggiungere i reagenti elencati di seguito in una
nuova provetta su ghiaccio nel seguente ordine:
a. 10 µL mix Nucleotide
b. 5 µL Tagged nucleotide
c. Reaction Buffer 5 µL (10X)
d. 5 µL primer casuali
e. 10 DNA µL bollito
f. 14 µL di acqua
g. 1 polimerasi DNA µL, frammento Klenow
6. Miscelare delicatamente e incubare a 37 °C
per 1 ora.
7. Bloccare la reazione con l’aggiunta di 2 µL EDTA.
8. Sonde Conservare a -20 °C al buio.