Hoefer HB1000 - Manual (Page 24)

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4. Ibridazione tampone acquoso o
denaturazione
Se ibridazione avviene in un ambiente acquoso sale
di 0,8-1,2 M di sale, T
m½
(temperatura alla quale
metà delle molecole duplex si dissociano sotto un
dato insieme di condizioni) può essere di 90 °C. Ciò è
sufficiente a degradare DNA, RNA e alcune proteine.
Potrebbe essere necessario aggiungere formammide
come denaturante/abbassamento della temperatura.
Per ogni punto percentuale di formammide aggi-
unto alla reazione del T
m½
è diminuito di 0,65 °C.
Pertanto, al 80% formammide, le reazioni possono
essere eseguite nel 40-55 °C gamma. D’altra parte, la
presenza di formammide richiede lunghe incubazioni,
poiché il tasso di formammide basata ibridazione
è almeno tre volte inferiore a quella di ibridazione
acquosa.
Protocollo
1
Priming metodo casuale per DNA tagging con marcato
con fluoresceina nucleotidi nucleotidiche o di altro
etichettati.
Questo metodo utilizza la DNA polimerasi di incorpo-
rare fluoresceina-11-dUTP in doppia elica sonde di
DNA. Questo protocollo può essere utilizzato anche
per incorporare eventuali nucleotidi marcati.
Attrezzatura
• Micropipette e puntali
• Microcentrifuga
• 1,5 ml microcentrifuga tubi
• Blocco Tappo per provetta
• Bagno di acqua bollente
• L’acqua bagno impostato a 37 °C