Hoefer HB1000 - Manual (Page 27)

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Procedimiento
1. Añadir 15 mL de solución de prehibridación a cada
botella que contiene la hibridación del borrón.
Eliminar las burbujas entre el cristal y el blot.
Tapar los frascos, adjuntar las botellas a las ruedas
del carrusel de soporte de la botella, y cerrar la
puerta del horno de hibridación.
2. Incubar el blot a 42 ºC durante 1 hora.
3. Quitar la solución de prehibridación y reemplazar
con 10 ml de solución de hibridación.
4. Si se utiliza sondas radiomarcadas trabajar de
forma segura desde el otro lado de un escudo beta-
bloqueante. Pipetear 1 × 10
6 cuentas por minuto
de sonda radiomarcada, o 200 ng de sonda biotini-
lada, en un tubo de plástico de 15 ml. Selle el tubo
con un tapón de plástico y hacer un agujero en la
parte superior con una aguja de jeringa para evitar
la acumulación de presión durante la ebullición.
5. Desnaturalizar la sonda mediante la colocación de
las muestras en el baño de agua hirviente y calenta-
miento durante 10 minutos. Transferir inmediata-
mente el tubo en hielo durante 5 minutos (para
evitar la renaturalización). Añadir 5 mL de tampón
de hibridación a la sonda y transferir a la botella
que contiene la hibridación del borrón. EVITAR
vertiendo la sonda directamente sobre la mancha.
6. Incubar en el horno de hibridación Hoefer HB1000
durante 6 a 8 horas a 42 hasta 56 ºC.
El lavado de la mancha
• Tupperware contenedor (dimensionada para contener
la mancha)
• 0,1X SSC, 0,1% SDS (precalentado a 50 ºC)
• 2X SSC, SDS al 0,1% (temperatura ambiente)
• 2X SSC (temperatura ambiente)
• 0,15X SSC, 0,1% SDS (precalentado a 50 ºC)
• Guantes
• Papel de filtro
• Cartón
• Envoltura de plástico
• Tape
Para sondas radiactivas, también necesitará:
• X-ray film titular
• Película de rayos X
• Intensificación de la pantalla