Hoefer HB1000 - Manual (Page 24)

•
p15
4. Hibridación acuosa o tampón
desnaturalizante
Si la hibridación se lleva a cabo en un entorno acuosa
de sal de 0,8 a 1,2 M de sal, la T
m½
(temperatura
a la cual la mitad de las moléculas dúplex se diso-
cian bajo un conjunto dado de condiciones) puede
ser de 90 °C. Esto es lo suficientemente alta como
para degradar el ADN, el ARN y algunas proteínas.
Puede ser necesario añadir formamida como un
agente desnaturalizante/disminución de la tempera-
tura. Por cada ciento de formamida a la reacción de
la T
m½
se reduce en 0,65 °C. Por lo tanto, en 80%
de formamida, las reacciones pueden llevarse a cabo
en los años 40-55 °C rango. Por otra parte, la pres-
encia de formamida requiere más incubaciones, ya
que la tasa de formamida basado en la hibridación es
al menos tres veces menor que la de la hibridación
acuosa.
Protocolo
1
Método de cebado aleatorio para el ADN marcado con
fluoresceína marcado con nucleótidos marcados de
nucleótidos o de otro.
Este método utiliza la ADN polimerasa para incorporar
fluoresceína-11-dUTP en sondas de ADN de doble
cadena. Este protocolo también se puede utilizar para
incorporar los nucleótidos marcados.
Equipo
• Micropipetas y puntas
• Microcentrífuga
• 1,5 mL tubos de microcentrífuga
• Tapón de bloqueo para tubo de microcentrífuga
• Baño de agua hirviendo
• baño de agua, regulado a 37 °C