Hoefer HB1000 - Manual (Page 24)

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4. Wässrige oder Denaturierung
Hybridisierungspuffer
Wenn Hybridisierung findet in einer wässrigen Umge-
bung Salz von 0,8 bis 1,2 M Salz, kann die T
m½
(die
Temperatur, bei der die Hälfte der Duplex-Moleküle
unter einer gegebenen Reihe von Bedingungen
dissoziieren wird) 90 °C sein, Dies ist hoch genug,
um DNA, RNA und einige Proteine abzubauen. Es
kann notwendig sein, Formamid als denaturierende/
Temperatur senkenden Mittel hinzuzufügen. Für
jedes Prozent Formamid zu der Reaktion hinzugefügt
wird die T
m½
um 0,65 °C reduziert Daher wird in
80% Formamid, können die Reaktionen in der 40
durchgeführt werden -55 °C Bereich. Auf der anderen
Seite erfordert die Anwesenheit von Formamid mehr
Inkubationen, da die Geschwindigkeit der Formamid-
basierten Hybridisierung ist mindestens drei-mal nied-
riger als die des wässrigen Hybridisierung.
Protokoll
1
Random Priming Verfahren zur DNA-Markierung
mit Fluorescein-markierten Nukleotid oder anderen
markierten Nukleotiden.
Diese Methode nutzt die DNA-Polymerase an Fluo-
rescein-11-dUTP in doppelsträngige DNA-Sonden zu
integrieren. Dieses Protokoll kann auch verwendet
werden, um alle markierten Nukleotiden einzubauen.
Ausrüstung
• Mikropipetten und Tipps
• Mikrozentrifuge
• 1,5 ml Reaktionsgefäße
• Cap-Sperre für Mikrozentrifugenröhrchen
• Kochendes Wasserbad
• Wasserbad auf 37 °C